基因診斷

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　　基因診斷是指利用DNA重組技術在分子水平上對人類遺傳病的基因缺陷進行檢測以診斷遺傳病的一種方法，又稱DNA分析法。

　　同以疾病表型改變為依據的前三代診斷技術相比，基因診斷具有如下特點：

　　①特異度高。基因診斷檢測的目標是基因，它是原始的致病因素，不同基因的鹼基序列是各不相同的。檢測基因的分子生物學方法亦是高度特異的，因此可以檢測出DNA片段的缺失、插入、重排，甚至單個鹼基的突變。

　　②靈敏度高。單拷貝基因雖然很少，難以檢測，但目前已有使基因或其片段高度擴增的PCR技術以及高靈敏度的基因探針可以應用，所以待測標本往往只需微量，目的基因只需Pg水平就已足夠。

　　③穩定性高。基因的化學組成是核酸，它比蛋白質穩定得多，長期保存的蠟塊中常能順利檢出。而且被檢測的基因不需要一定處於活性狀態。

　　④診斷範圍廣，適用性強。基因診斷不僅能對某些疾病作出確切的診斷，如確定有遺傳病家族史的人或胎兒是否攜帶致病基因等；也能確定與疾病有關聯的狀態，如對疾病的易感性、發病類型和階段、是否具有抗藥性等進行檢測。

　　⑤臨床應用前景好。隨著分子生物學技術的普及，在配備有一定的儀器和試劑盒的情況下，在臨床實驗室開展基因診斷是完全可能的。

　　1.臨症基因診斷

　　醫生根據患者病史、癥狀，為明確或排除某一疾病而進行的檢查。如Vega等對疑為利什曼原蟲所致皮膚病的患者採用PCR的方法以明確診斷。

　　2.癥狀前基因診斷

　　主要用於一些遺傳病家系或有遺傳病傾向的家系中目前未發病、但有高度發病風險人群的診斷，特別適用於一些早期診斷後可進行預防性干預措施，避免出現嚴重不良後果的疾病。Wu等對51個無關Wilsons病家系78位患者的未發病親屬進行了癥狀前診斷，對明確為癥狀前患者的個體給予硫酸鋅預防性治療，隨訪3～5年，無一齣現臨床癥狀和不良反應。

　　3.產前基因診斷

　　產前基因診斷又稱出生前診斷，主要是針對一些有生育患兒風險夫婦的胎兒進行診斷 對明確診斷為某種疾病的胎兒可採取干預措施。對目前尚無治愈可能的疾病的胎兒可實施選擇性流產。產前基因診斷採用的標本常為絨毛膜標本和羊水標本，這兩種標本的獲取對母嬰均有一定的創傷。近年來已可用孕婦外周血中的胎兒有核細胞或游離胎兒DNA進行產前基因診斷。例如，Gonzalez等採用熒光半定量PCR檢測妊娠早期母親血清胎兒游離DNA產前診斷Huntingtons病。

　　4.胚胎植入前遺傳學診斷

　　即Preimplantation GeneticDiagnosis(PGD)技術，該技術適用於有生育患兒可能又不願經產前診斷選擇性流產的夫婦。常用的方法是待受精卵分裂至6～8個細胞的卵裂球階段時，取其中1～2個細胞進行基因診斷，挑選正常胚胎植入母體。

　　1.直接診斷

　　基因測序是診斷基因突變的金標準，但實際工作中不可能對疑有突變的標本逐一做基因測序。雜交技術和PCR技術是直接基因診斷的兩大基本技術。對於需對DNA或RNA進行定位檢測或為染色體異常的疾病，常採用雜交技術，包括熒光原位雜交(FISH)、Southem雜交、反向點雜交等。如用FISH分析無精子症患者精子的染色體異常。雜交技術中常存在信號不足的問題，Qian等介紹了多種原位雜交中信號放大的方法。若標本中靶DNA含量較低，不易直接檢測突變基因，可採用PCR擴增後再檢測，常用的方法有：常規PCR、等位基因特異性PCR、甲基化特異性PCR、RQ-PCR、RT-PCR、PCR-SSCP、PCR-DEGE等。對於一些靶DNA含量很低(如胚胎植入前診斷的標本常只含1～2個拷貝的目的DNA)的標本，需採用巢式PCR或全基因組擴增後續PCR。在實際工作中常將多種檢測技術結合起來使用，如Wu等採用多重引物延伸與變性高效液相色譜(DHPLC)相結合的方法，檢測中國人群中β-球蛋白基因的五種主要基因突變，準確率達100％。

　　近年來，生物晶元技術在基因診斷中的應用增多如用於骨髓增生不良綜合徵(MDS)進展機制的研究 ，腫瘤基因表達及其重要標誌物的研究。

　　2.間接診斷

　　間接診斷是當基因結構不清或結構複雜或突變過多而無法逐一檢測，利用與某種疾病基因緊密連鎖的多態性標誌來判斷待檢者是否帶有某一致病基因。第一代多態性標誌是限制性片段長度多態性(RFLP)，第二代是數目可變的串聯重覆序列(VNTR)和短串聯重覆序列(STR)，第三代是單核苷酸多態性(SNP)。Balci等採用RFLP分析了土耳其家族性地中海熱的基因突變，建立了該病的基因診斷方法。多態性標記的應用受到多態信息含量和基因重組等因素的影響，但第三代標記SNP的多態信息含量豐富，結合晶元技術在一些複雜疾病的診斷中將發揮重要作用。

　　基因診斷的應用主要表現在以下幾個方面：

　　1.遺傳性疾病的基因診斷

　　目前已發現的人類遺傳性疾病達數千種之多，分為單基因缺陷造成的遺傳病(包括顯性遺傳、隱性遺傳、X-染色體連鎖遺傳病等)、多基因缺陷導致的複雜因素遺傳病以及染色體數目異常的遺傳病。對於遺傳病的早期診斷及防治是醫學領域的重要任務。隨著對多種遺傳病致病基因和突變類型以及許多可用於基因連鎖分析的遺傳標誌的澄清，再加上基因診斷方法學的不斷改進和更新，使得基因診斷被廣泛地應用於遺傳病的診斷中。目前遺傳病基因診斷所取得的成績最為顯著和突出。地中海貧血是一種常見的危害嚴重的遺傳性血液病。Drobyshev等用10聚體的寡核苷酸微集晶元，成功檢測β-地中海貧血患者紅細胞中β-珠蛋白基因中的3個突變位點。血友病B是凝血因數Ⅸ(FⅨ)基因缺陷引起的一種x染色體連鎖隱性遺傳病，關節腔和肌肉出血是嚴重病例的特征性表現。劉湘帆等應用PCR和Genescan法分別檢測87例正常人和8個血友病B家系(35人)的8個STR位點的多態性，併進行家系遺傳連鎖分析。所檢測的8個STR位點中6個可提供遺傳信息。綜合運用基因診斷技術，配合包括免疫化學、蛋白質化學及酶活性測定的其他分子檢驗技術以及傳統的病理檢查，目前臨床上可以成功地檢測幾百種遺傳病，特別是用於胎兒的產前基因診斷 和對於攜帶致病基因者的預防性監測。

　　2.腫瘤的基因診斷

　　腫瘤的形成是遺傳因素與環境因素相互作用的結果。與腫瘤相關的基因包括癌基因、抑癌基因及DNA錯配修複基因等。當癌基因、抑癌基因發生突變時，癌基因活化，抑癌基因失活，以及其他基因異常不斷積累，導致腫瘤發生、發展。因此，檢測癌基因、抑癌基因中發生的基因突變有助於腫瘤的早期診斷。

　　1998年Hacia等用DNA晶元檢測了乳腺癌和卵巢癌基因BRCA1第11外顯子，全長3．45kb的突變體，檢測的15例患者中，準確率高達99％。抑癌基因p53是人類腫瘤中最常見的突變基因，約50％ 以上的腫瘤都存在該基因的突變。有些組織類型D53基因突變率高，如小細胞肺癌約為75％ ，大腸癌約70％等。通過將p53基因外顯子2～11區域內所有突變位點的突變探針以及對應的正常序列探針集成在一塊晶元上，製成D53基因晶元，可為腫瘤的早期診斷、分類提供一條新途徑。Ahrendt等應用該晶元檢測了100例早期肺癌患者的p53基因序列，並與測序結果相比較，該晶元檢測突變的準確率達98％。

　　3.感染性疾病的基因診斷

　　採用形態學、生物化學或血清學方法診斷細菌、病毒、寄生蟲和真菌等感染性疾病，有時存在靈敏度低、特異性差及速度慢等不足之處，因為有些病原體侵人體內後需潛伏一定時間後才出現抗體，用血清學和常規生化方法很難及時診斷出來。如艾滋病病毒的血清學診斷只能確定是否有這種病毒接觸，而不能肯定是否存在現行感染；從細胞中分離病毒又很費時，且有時極為困難。基因診斷技術則可剋服這些不足，它既能檢出正在生長的病原體，也能檢出潛伏的病原體；既能確定既往感染，也能確定現行感染。Lipshutz等應用含有18495個寡核苷酸探針的微集陣列，對HIV-1基因組中逆轉錄酶基因與蛋白酶基因的多態性進行了分析。這兩個基因在疾病過程中容易發生突變，這些突變將導致病毒對多種抗病毒藥物如AZT、DDI等產生抗藥性，利用基因晶元技術可為愛滋病病毒抗藥性的判斷提供可靠的依據。PCR技術可直接靈敏地探測病毒基因組或病毒基因轉錄產物，而不依賴於血清學檢驗所要求的病毒抗原表達。因此，可在感染的潛伏期內診斷感染源，以利及時採取相應治療措施。

　　4.基因診斷在法醫學鑒定中的應用

　　在這一領域的應用主要是針對人類DNA遺傳差異進行個體識別和親子鑒定。其中最常用的基因診斷技術是DNA指紋技術、建立在PCR技術基礎之上的擴增片段長度多態性(Amp-FLP)分析技術，以及檢測基因組中短串聯重覆序列(STR)遺傳特征的PCR-STR技術和檢測線粒體DNA(mt DNA)的PCR．mtDNA技術。

　　5.疾病易感性的基因診斷

　　基因診斷在判斷個體對某種重大疾病的易感性方面起著重要作用。如人類白細胞抗原human leukocyte antigen，HLA)複合體的多態性與一些疾病的遺傳易感性有關。白種人類風濕性關節炎患者HLA．DR4攜帶者高達70％，而正常人陽性率僅28％ 。運用HLA基因分型對HLA多態性進行分析，既準確又靈敏，能檢出血清學和細胞學分析方法無法檢出的型別。根據所檢測的結果即可進行疾病易感性判斷。

　　6.基因診斷在器官移植組織配型中的應用

　　器官移植(包括骨髓移植)的主要難題是如何解決機體對移植物的排斥反應。理想的方法是進行術前組織配型。基因診斷技術能夠分析和顯示基因型，更好地完成組織配型，從而有利於提高器官移植的成功率。